Neisseria, Neisseriaceae familyası içerisinde yer alan, diplokok şeklinde gram negatif koklardır. Neisseria cinsi organizmalar insanda kommensal olarak bulundukları gibi, patojen türleri de mevcuttur.  Patojen Neisseria’lar adi ortamlarda ya üremezler veya çok hafif ürerler. Neisseria gonorrhoeae ve Neisseria meningitidis insanlar için patojen olan iki önemli Neisseria türüdür. Üremeleri için zenginleştirilmiş besiyerlerine gereksinim gösterirler. Fermentasyon kabiliyetleri azdır. Bazı türleri sarımtırak pigment yaparak ürerler. Neisseria türleri genel olarak aerobiktirler. Katalaz ve oksidaz reaksiyonları pozitif, indol negatiftirler. Niratları nitrite çeviremezler (1).

TARİHÇE

Neisseria grubunun ilk üyesi N.gonorrhoeae 1879’da Neisser tarafından gonoreli bir hastanın üretral ve konjonktival akıntısından tarif edilmiş ve 1885’te Bumm tarafından izole edilmiştir. Aslında gonorenin, cinsel yolla bulaşan bir hastalık olduğu 13. yüzyıldan beri bilinmekteydi. Ancak 19. yüzyılın ortalarına kadar sifilizden farklı bir hastalık olduğu anlaşılamamıştı. Neisseria cinsinin ikinci patojen üyesi N.meningitidis ise 1884’de Marchiofava ve Celli tarafından meningeal eksudada tanımlanmış, 1887’de Weichselbaum tarafından menenjitli bir hastanın beyin omurilik sıvısından (BOS) izole edilmiştir. 1896’da Kiefer, 1901’de Albrecht sağlıklı kişilerde meningokok taşıyıcılığını ortaya atmışlardır.

Menenjite neden olan N.meningitidis ve gonore etkeni olan N.gonorhoeae dışında, patojen olmayan veya saprofit olarak tanımlanan Neisseria türleri normal orofaringeal floranın üyesi olarak yer alırlar. Ancak bu bakteriler, immün sistemi baskılanmış kişilerde endokardit ve bakteremi gibi yaşamı tehtit eden infeksiyonlara yol açabilirler.

1902’de Ghom ve H.Pfeiffer, 1906’da Lingelschein, sağlıklı ve hasta insanların nazofarinkslerinden bir çok gram-negatif kok izole etmişlerdir. Bunlar N.lactamica, N. sicca, N.subflava, N.flavescens, N.mucosa, N.cinerea, N.denitrificans, N.elongata ve N.canis’ tir.

Son yıllarda N.gonorrhoeae’ nin antibiyotik direnç paterninde değişiklik meydana gelmiş ve 1976’da penisilinaz meydana getiren ilk N.gonorrhoeae (PPNG) suşu izole edilmiştir. Günümüzde PPNG endemiktir. Kromozomal penisilin direnci ve plazmidal yüksek seviyeli tetrasiklin direnci gonokokal infeksiyonların tedavisinde önemli bir sorundur(2)

NEİSSERİA’LARIN GENEL ÖZELLİKLERİ

Neisseriaların tümü gram negatif koktur. Aynı tür dahi, çevre şartlarının etkisi ile değişiklik gösterir. İkili koklar şeklinde veya kısa zincirler halinde görünürler. Düz veya bir yüzeyleri kahve çekirdeği şeklinde hafif iç bükeydir. Konkav olan bu yüzeyleri ile karşı karşıya dururlar. Hareketsiz, sporsuz, 35oC-37oC’de üreyen mikroorganizmalardır. Kapnofiliktirler ve en iyi, nemli ortamda ürerler. Kültürde oval veya yuvarlak diplokok şeklinde görülürler. Bir çoğu dörtlü veya küçük gruplar halinde bazıları örneğin N.subflava’da olduğu gibi yoğun kitleler şeklinde, nadiren tek tek görünürler. Neisserialar renklerini alkol ile kolay ve çabuk bırakırlar. Ancak bazıları viyole renklerini muhafaza ederler. Bu durum daha çok yoğun kitle oluşturanlarda görülür. Bu olumsuzluğu gidermek için boyanacak preparat mümkün olduğu kadar uniform ve ince hazırlanmalıdır. Yine kültürlerde, koklar homojen boyanırlar. Ancak 24 saat sonra otolitik değişmeler başlar ve involüsyon şekilleri ortaya çıkar. Koklar şişerler ve hafif boyanırlar. Meningokok ve gonokoklarda da, diğer neissserialarda olduğu gibi, bu şekiller ortaya çıkar. Bazı araştırıcılar Neisseria grubunda metakromatik granüllerin varlığını bildirmişlerdir. Meningokoklar Löflerin metilen mavisi ile boyandıkları zaman kokun ortasında soluk boyanan bir leke görülür,diğer kısımlar daha koyu boyanır. Neisser’le boyama ile granüller mavi-siyah diğer kısımlar kahverengi boyanır. Woithe gonorenin akut döneminde, gonokokların granüllerle dolu olduklarını göstermiştir. Elekron mikroskopisi ile N. gonorhoeae, N.subflaya’da fimbriaların varlığı tesbit edilmiştir.

Neisseriae’ların hücre duvarında %6-8 arsında mukopeptid, geniş çapta aminoasit ve lipid bulunmaktadır. G+C oranı %50’dir. Gonokoklarda penisilin türevleri ile L-formlar oluşur.

KÜLTÜR ÖZELLİKLERİ

Nazofarinkste bulunan ve kolonize olan koklar, adi vasatlarda iyi ürerler. Meningokoklar ise ilk izolasyonlarında kan faktörleri, serum, doku ekstreleri ve haben gibi besleyici faktörlere faktörlere ihtiyaç gösterir. Birkaç pasajdan sonra adi vasatlarda da üremeye alışırlar. Ancak adi vasatlarda da canlı kalması şansı düşüktür. Gonokoklar üreme faktörleri bakımından daha nazlıdır. Çikolata agarı, hemoglobin, maya ekstresi, nişasta, glikoz, sistin veya serum gibi besleyici maddeler ilave edilmiştir. Thayer-Martin gibi vasatlarda daha iyi ürerler. Ekim maddelerinden gonokok izalosyonu için, kontamine edici mikroorganizmaların inhibasyonu için antibiyotik ilave edilebilir. %10 kan içeren, pH 7.4 kaynatılmış kanlı (çikolata) agarda iyi ürer.

Nemli ortamda, 350C-370C arasında ve %5-10 karbondioksitli ortamda daha iyi ürerler. Ekim alanında vasatlar nemlendirilmeli, etüvün havası su buharı  ile doyurulmalıdır (Etüve ağzı açık bir kapla su konmalıdır). Muhafaza için %0.75 agar içeren pH 7.4 %10 kanlı çikolata agarında batırma kültürü yapılarak ve tüpün ağzı sıkıca kapatılarak etüvde tutulur. Yatık agarda tutulma zorluğu varsa, gonokok  ve meningokok kültürleri, her 2-3 günde bir pasaj edilmelidir. Hidrolize kazein ve et infüzyonu içeren Mueller- Hinton vasatı da kültür için uygundur. Frantz 1942’de meningokokları, glutamik, asit, sistin, glikoz, ve inorgonik tuzlardan ibaret sentetik bir vasatta üretebilmiştir. Ortama kalsiyum eklenirse, üremenin daha iyi olacağı saptanmıştır.

 Neisserialar aerobik olarak ürerler. Ortama –SH kaynağı maddelerin ilavesi ile gonokoklar daha iyi ürerler. Meningokok ve gonokoklarda düşük oksijen basıncı altında ve %10 CO2 varlığında üreme daha aktive olur. CO2  varlığı, özellikle ortamın reaksiyonu alkali olduğu zaman, daha etkili olmaktadır. İlk izolasyonlarda CO2’in üreme üzerine olan etkisi daha fazladır. %1-3’lük pepton ilavesi üremeyi kolaylaştırdığı halde, glikoz ve gliserin fazla etkili değildir. Optimal pH 7.4’tür. pH değişmelerine daha duyarlıdır. Optimal üreme ısısı 35-37oC’dir. Gonokok ve meningokoklar 30oC altında üremezler. Grubun diğer üyeleri ise 22-40oC arasında üreyebilir. Meningokoklar kanlı ortamda hemoliz yaparlar ve hemoliz dördüncü güne doğru maksimal düzeye ulaşır (geç hemoliz).

Grubun bazı üyeleri katı ortamda sarı-yeşil pigment yaparlar. N. canis ise açık sarı pigment yapar. Gonokok ve meningokoklar ortamda otoliz olayından şişerler ve boyanma kabiliyetlerini kolay kaybederler. Otolitik sistem ısıya duyarlı olup 65oC’de 30 dakikada harap olur.

 Neisseriaların koloni formasyonları değişkendir. Meningokoklar, S tipi lentiküler formda koloni yapar. Kapsüllü olduğu taktirde koloni mukoid olur. Birkaç gün içinde koloni değişiklikliğe uğrayarak kenarları girintili çıkıntılı bir hal alır, koloni yüzeyinde pililer oluşur. B grubunda olanlar kapsülsüz olduklarından küçük koloni yaparak ürerler. Kolonilerin çapı vasatın içeriği ile ilişkilidir. Meuller-Hinton ve Thayer- Martin ortamlarında 1-5 mm çapında opak, transparan koloni oluştururlar. N.gonorrhoeae daha küçük koloni yaparak ürer. Sulu ortamda Neisserialar daha hafif ürerler ve ortam hafif bulanık olur. Mc Conkey vasatında üremezler. Üreme ve biyokimyasal reaksiyonları Tablo 147.1’de gösterilmiştir.

Tablo 147.1: Neisseria’ların üreme ve biyokimyasal reaksiyoları (3)

TÜR                         ÜREME                                     ASİT ÜRETİMİ NİTRATIN İNDİRGENMESİ SÜKROZROZDAN POLİSAKKARİD ÜRETİMİ
MTM, ML, NYC AGAR ÇİKOLOTA VEYA KANLI AGAR NUTRİENT AGAR GLUKOZ MALTOZ LAKTOZ SÜKROZ FROKTOZ
N.gonorrhoeae + 0 0 + 0 0 0 0 0 0
N.meningitidis + 0 V + + 0 0 0 0 0
N.lactamica + V + + + + 0 0 0 0
N.cinerea V 0 + 0 0 0 0 0 0 0
N.polysaccharea V + + + + 0 V 0 0 +
N.subflava V + + + + 0 V V 0 V
N.sicca 0 + + + + 0 + + 0 +
N.mucosa 0 + + + + 0 + + + +
N.flavescens 0 + + 0 0 0 0 0 0 +
N.elongata 0 + + 0 0 0 0 0 0 0

+, tipik suşlar pozitif (mutant suşlar negatif olabilir); V, suş bağımlı; 0, negatif

MTM, modifiye Thayer Martin besiyeri; ML, Martin-Lewis besiyeri; NYC, New York City besiyeri.

BİYOKİMYASAL REAKSİYONLAR

Neisserialar biyokimyasal olarak fazla aktif değildirler. Katalaz ve oksidaz reaksiyonları pozitiftir. Glikoz, maltoz ve sakkaroza olan etkilerinden yararlanılarak tipilendirilmeye çalışılır.  Asitli ve serumlu vasatlara şeker ilave edilerek, biyokimyasal reaksiyonlar incelenir. Birçok araştırmacı tipik buyyona %5 tavşan serumu %0.15 agar ve %0.2 fenol red  ilave ederek kullanılmasını önermektedirler. İnsan nazofarenksinden  izole edilen Neisserialar daha ziyade disakkaridleri fermente ederler.  Neisserialardan yalnız N.canis proteolitiktir. Metil kırmızısı reaksiyonu hafif pozitif ve çoğu kez  negatif iken, Voges- Proscauer reaksiyonu çoğu kez pozitiftir.

DİRENÇLİLİK

Dış etkenlere karşı oldukça duyarlıdırlar. Kültürde birkaç gün içinde ölürler. Neisserialar %75’lik asitli agarda batırma kültürü yapılarak, kurumaya karşı önlem alınarak  35oC-37oC etüvde tutuldukları takdirde, haftalarca canlı kalabilirler. Kültürde çok çabuk ölmelerinin nedeni bilinmemekle birlikte, metabolizma sırasında oluşan amonyağın ortamı kuvvetli alkali yapmasından ileri geldiği sanılmaktadır. 55oC’de 5 dakikada, kurulukta 1-2 saatte ölürler. Liyofilizasyonda çok sayıda gonokok ölür. %1’lik fenol, %0.1 civa solüsyonları 1-2 dakikada Neisseriaları öldürür. Meningokokların grup B ve C’de olanları daha fazla dirençlidirler (1,2)

SINIFLANDIRMA

  1.             Neisseriaların sınıflanması, gonokok ve meningokok dışındaki türlerin özelliklerinin yeterince anlaşılamamış olması nedeni ile zordur. Meningokok ve gonokok dışındaki Neisserialar ile ilgili anektodal vaka bildirimleri bildirilmekle birlikte son derece nadir olarak karşımıza çıkmaktadırlar (4,5). Bunların koloni görünümleri çok farklı olup aynı türün koloni özellikleri değişik araştırıcılar tarafından, çok farklı tarif edilmiştir.  Nazofarinkste kolonize olan neisserialar, pigment yapıp yapmama, S ve R tipi koloni yapma, az sayıda monosakkarid ve disakkarid şekerini fermente etme yönünden değişiklik gösterirler.

N.elongata ve N.weaveri diğer  Neisseria’lardan farklı olarak şişkin ve geniş, diplokoklar veya kısa zincirler halinde görülür.

N.gonorhoeae yalnız glikozu fermente ederken, N.meningitidis ve nazofarengeal koklardan N.subflava grubu glikoz ve maltozu, N.sicca ise bunların yanında sakarozu da parçalar.

N.subflava grubu koklar sarı-yeşil pigment yapar. Bu grupta: N.pharyngisflava I. II ve III, N.flava, N.subflava  ve N.perflava dahil edilmiştir. Bunların kendi aralarında fark çok azdır ve hepsi N.subflava olarak isimlendirilmiştir. N.gonorhoeae ve N.meningitidis birbirine çok yakın özellik gösterirler. Gonokoklar, besleyici maddelere gereksinimleri bakımından, kültürde küçük koloni yaparak ve yavaş ürerler. Kolonileri hafif yapışkanlıdır. Kolay süspanse olmazlar. Glikozu fermente ederler. Meningokok kolonileri, fare ve kobaylara periton içi verilirse, daha kolay ve çabuk süspane olurlar. Ancak gonokoklar kadar toksik etki yapamazlar. N.gonorrhoeae, N.meningitidis, N.lactamica, N.sicca, N.subflava, N.mucossa, N. Flavescens, N.cinerea, N.polysaccharea ve N.elongata insanlardan izole edilmiş olan neisserialardır. Hayvanlardan izole edilen suşlar arasında N.canis ve N.weaveri köpeklerin normal solunum yolu florasından, N.denitrificans. N.animalis ve N.caviae kobayların normal solunum yolu florasından, N.ovis koyun ve keçilerin oral florasından, N.cuniculi tavşanların üst solunum yollarından izole edilmiştir (1,7,9).

PATOJENİK NEİSSERİA’LARIN VİRULANS FAKTÖRLERİ

Diğer gram-negatif bakterilerde olduğu gibi, neisseria cinsi bakteriler de içte sitoplazmik memrana, ince bir peptidoglikan tabakaya ve lipooligosakkarit (LOS), protein ve fosfolipidlerden meydana gelmiş bir dış  membrana sahiptir. Diğer gram negatif  bakterilerden farklı olarak, gonokokal ve  meningokokal lipopolisakkaritlerde uzun O somatik antijenik yan zinciri yoktur. Bundan dolayı lipooligosakkarid (LOS)  adını almıştır. Molekül ağırlığı 3.000-7.000’dir. Gonokoklar birden fazla değişik antijenik LOS taşırlar. LOS’un yapısal değişimleri bakteriyel aderens ve ataşmana etki edebilir ve normal insan serumu tarafından  hücrelerin öldürülmesini etkileyebilir. Gonokok infeksiyonlarında görülen toksik durum, LOS’un endotoksik etkisinden ileri gelmektedir. N.meningitis’in LOS’u da yapısal ve antijenik farklılık gösterir ve en az 12 LOS serotipi tanımlanmıştır. Gonokokal peptidoglikan öğeleri virulans faktör olarak fonksiyon görülebilir (1).

Patojenik Neisseriaların yüzey yapıları immünojenik olmaları nedeni ile aşı çalışmalarında denenmektedir. N.meningitidis hücre yüzeylerinde pili adı verilen tüy benzeri protein polimerlerinden meydana gelmiş yapılara sahiptir. Pililer organizmanın mukozal yüzeylere tutunmasını sağlar. Pilili gonokoklar duyarlı hücrelere bağlanır ve infeksiyon süreci başlayabilir. Gonokokal piliye karşı antikorlar, aderensi inhibe edebilir. Gonokokal pili nötrofiller tarafından fagositoza da karşı koyar. Gonokokal pili pilin protein subunitlerinden meydana gelmiş olup moleküler ağırlığı 16.5-21.5 kDa’dur. Daha az gösterilmiş olmakla birlikte yeni izole edilmiş meningokokların nazofarenks mukozasına tutunmasını sağlar. Beyin omurilik sıvısındaki meningokokların da in vivo olarak piliye sahip oldukları gösterilmiştir. Ancak meningokokal pililerin organizmanın kan-beyin bariyerini aşmadaki rolü ve menengeal doku ile ilişkisi bilinmemektedir.

Gonokokal pili faz varyasyonu ve antijenik varyasyon altındadır. İn vitro olarak, pilili (P+ ve P++) ve pilisiz  (P-) gonokoklar arasında faz varyasyonu sıklıkla meydana gelir. Bu durumda pil genleri (pili proteinleri için yapısal genler) ekspresse edilemeyebilir (pili proteinleri meydana gelmez) veya pili proteinleri sentez edilir, fakat fonksiyonel pili haline getirilemez. Antijenik varyasyonda pil genleri, kopyalanmalar sırasında yeni antijenik pili tiplerinin meydana gelmesine yol açabilir. 20’in üzerine pil geni tanımlanmıştır (10,11)

  1. N.gonorrhoeae bakteri hücresi dış membranında çok sayıda protein içerir. Gonokokal dış membran proteinleri, antikor cevabının oluşması, hücresel immün cevap, lökosit toplanmasında azalma ve normal insan serumunun bakterisidal etkisine karşı koyma gibi bir çok biyolojik aktiviteye sahiptir. Porin proteinleri, Por veya Protein I olarak adlandırılan, ısıya dayanıklı, LOS’la ilişkili proteinlerdir. Bu proteinler dış membranın genişliği boyunca uzanır ve küçük moleküllerin periplazmik sahaya giriş çıkışını sağlarlar. Por epitoplarına karşı hazırlanmış monoklonal antikorlar son zamanlarda gonokokların serotiplendirmesinin esasını oluşturmaktadır.
  2. N.gonorrhoeae dış membranında Opa geni tarafından kodlanan “opacity” (Opa) (Protein II olarak da adlandırılır) proteinleri yer alır. Bu protein gonokokların kendi aralarında birbirlerine ve hücreye tutunmalarını sağlar. Opa molekülünün bir kısmı gonokokların dış membranında, geri kalan kısmı ise hücre yüzeyinde bulunmaktadır. Opa proteinlerinin moleküler ağırlığı 20-28 kDa’dır. Organizma 10-12 tam opa genine sahiptir. Bir gonokok suşu Por proteininin tersine 1,2 veya 3 Opa taşıyabilir. Opa opak (mat) koloni yapan gonokoklarda bulunmakta olup, şeffaf koloniler yapanlarda saptanmamıştır.
  3. Gonokokal proteinin üçüncü tipi, Protein III veya Rmp (reduction modifiable protein) olarak adlandırılan 30-31 kDa molekül ağırlığındaki proteinlerdir. LOS ve Por ile ilişki halindedir. Por, Opa ve Rmp proteinleri ve diğer birkaç dış membran proteini, N.gonorrhoeae’da tanımlanmıştır. Bu proteinlerin bazıları insan transferrini ve laktoferrin için reseptör olarak fonksiyon görür ve belki de bakteri metabolizması için gerekli olan demiri edinmek için rol oynar(12).
  4. Virulan N.meningitidis suşları polisakkarit bir kapsüle sahiptir. 13 farklı kapsüler serogrup tanımlanmıştır. Kapsül, özellikle opsonize edici antikorların yokluğunda organizmayı fagositozdan korur. N.meningitidis’in dış membranında bazı protein antijenleri vardır. LOS antjenleri tipe- spesifik antijenisiteden sorumludur. N.meningitidis’in dış membran  proteinleri molekül ağırlığına göre 5 sınıfa ayrılır; Sınıf 1; 44-47 kDa, Sınıf 2; 40-42 kDa, Sınıf 3;37-39 kDa, Sınıf 4; 33-34, Sınıf 5; 26-30 kDa. Bu proteinlerin tümü dış membran yüzeynde bulunur ve molekül ağırlığına ilaveten tripsin ve deoksikolata duyarlılıkları, ve ısı ile denatürasyonları da farklıdır. Bütün meningokoklar ya sınıf 2 ya da sınıf 3 Omp’a (outer membrane protein) sahiptir. Fakat asla ikisi birden bulunmazlar. Buproteinler dış membranın predominant proteinlerdir. Porin proteinleri olarak iş görürler ve serotipe spesifiktir. Sınıf 1 ve sınıf 5 proteinler meningokokların çoğunda bulunur. Meningokokların epidemiyolojik çalışmalarında kullanılan diplendirme sistemi sınıf 2 veya sınıf 3proteinleri ve LOS determinantlarındaki antijenik farklılıklarla beraber polisakkarit grup antijeni esas alınarak yapılır. Protein 1 ve 5’te bulunan antijenik determinantlar eğer mevcutsa, subserotiplendirmede kullanılır. Örneğin; meningokok serotip C:2b: P1.P5.2;L3,7 denildiğinde, grup C meningokok, serotip b sınıf 2 protein, serotif 3 sınıf 1 protein, serotip 2 sınıf 5 protein, ve LOS tip 3  ve 7 olduğu ifade edilmektedir.
  5. Patojenik Neisseria suşlarında virulansa katkıda bulunan başka faktörlerde vardır. Gonokoklar ve meningokoklar, humoral ve sekretuar IgA’nın etkisini ortadan kaldıran IgA proteaz meydana getirirler. Meningokokal IgA proteaz immünolojik olup asemtomatik nazofaringeal taşıyıcılarda ve İnfeksiyon sırasında bu enzime karşı antikor gelişir. N.meningitidis serogrup B’nin kapsüler materyeli immünojenik olarak, insan santral sinir sisteminde bulunan nörominik asitten ayırt edilemez. Dolayısı ile bu organizmanın kapsülü insan immün sistemi tarafından yabancı olarak tanımlanmaz ve tam olarak nonimmünojeniktir.

N.gonorhoeae ve N. Meningitidis zor üreyen mikroorganizmalar olup, zenginleştirilmiş besiyerlerine gereksinim vardır. Örneğin; N.gonorhoeae, amino asit sistein olmazsa üremeyecektir. Gerçekten N.gonorhoeae’nin ihtiyacı olan amino asitler, vitaminler, pürinler ve pirimidinler gonokokol izolatların tiplendirilmesi için gereklidir. Nütrisyonel ve atmosferik durumlar da  gonokokların meningokokların virülansına katkıda bulunur. Bu organizmaların kolonizasyonu ve takiben mukozal yüzeylerin infeksiyonu için demire ihtiyaçları vardır ve her iki mikroorganizma enzimatik metodlarla transferin ve laktoferrinden ihtiyaçları olan demiri yapabilirler. Bu enzimatik özelliğin eksik olduğu gonokokal mutantların hayvan modellerde avirulan olduğu gösterilmiştir. Hemoglobin bağlayıcı proteinler N.meningitidis’in yüzeyinde de gösterilmiştir. Gonokokların elektron akseptörü olarak nitrit varlığında anaerobik olarak da üredikleri gösterilmiştir. Bu özellik gonokokların yeni ve genetik olarak farklı düzenlenmiş dış membran proteinlerinin meydana gelmesine yol açar. Anaerobik olarak çoğalabilme özelliği, gonokokların endoserviks, rektum, genital sistem ve farinkse yerleşmesine ve pelvik inflamatuar hastalık yapmasına neden olur. Bu sahalardan kültür yaparken bakterinin anaerob özelliği göz önünde bulundurulmalıdır. (1,13,14).

DİĞER NEİSSERİA TÜRLERİ

Neisseria lactamica gonokoklar ve meningokoklar için olan seçici besiyerlerinde üreyebildiği için bu organizmalardan ayrılması gerektiğinden ayrı bir öneme sahiptir. Bu mikroorganizma daha çok çocukların orofarinksinde bulunur. Gold ve arkadaşlarının 2969 çocuk üzerinde yaptıkları araştırmalarında özellikle 18 aylık çocuklarda %21 taşıyıcılık oranı ile pik yaptığı, bu oranın 14-17 yaşta %1.8’e indiği gösterilmiştir (15). Antijenik çapraz reaktivite nedeni ile N.lactamica taşıyıcılarınada N.meningitidis grup A B ve C ‘ye karşı bakterisidal antikorlar meydana  geldiği aynı araştırıcı tarafından gösterilmiştir. Nadiren çocuk ve erişkin menenjitlerine neden olduğu bildirilmiştir. Otidis media ve immünsupresif hastalarda sepsise neden olabilmektedir. Penisiline dirençli N.lactamica suşları giderek artış göstermektedir. Bu dirençli suşlar, penisiline dirençli N.meningitidis’de olduğu gibi değilmiş penisilin bağlayıcı proteine  (PBP 2) sahiptir ve PBP 2 ‘ye afinitesi azalmıştır (16).

N.neisseria subflava (biovarlar flava, suflava ve perflava), N.mucosa, N.sicca ve N.flavescens daha çok doğal ve yapay kapak endokarditlerine neden olmaktadır. Bu bakteriler immün durumu bozuk hastalarda ve AİDS hastalarında bir çok sistemi etkileyebilmektedir (17-19).

Neisseria cinerea üst solunum yollarının saprofit bakterisidir. Ancak kültür özelliklerinin N.gonorrhoeae’ya benzemesi ilginçtir. AİDS hastalarında nozokomiyal pnömoniye ve lemfedenite neden olduğu bildirilmiştir (20,21).

Neisseria polysaccharea bir diğer solunum yolu kommensaldir. Patolojik olduğuna dair veri yoktur.

Neisseria canis ve N.denitrificans hayvanların üst solunum yollarından izole edilmiştir.

Neisseriaların çomak şeklinde olan üyeleri N.elongata’nın üç alt türü (subsp. Elongata, glycolytica, nitroreducens) ve N.weaveri’dir. Bu mikroorganizmalar solunum yollarının normal flora üyeleridir (6,7,21)

PATOJEN NEİSSERİALARIN İZOLASYONU

Neisseria gonorrhoeae’nın izolasyonu(22-24)

Örneklerin alınması:

N. gonorrhoeae için  örnek alınırken özen göstermenin önemi büyüktür.  Örnekler genital bölgelerden (erkeklerde üretra, kadınlarda endoserviks) alınmalıdır. Sürüntü örnekleri Dacron veya yapay ipek içeren malzemeler yardımı ile alınmalıdır. Kalsiyum alginat toksik olabilir ve pamuk kaplı malzemelerdeki yağ asitleri gonokokların üremesini inhibe edebilir (3). Servikal kültürlerin duyarlılığı %85’dir. Gonoreli kadınların %90’ında servikste İnfeksiyon mevcuttur. Orogenital veya anogenital ilişki tanımlanıyorsa bu bölgelerden de örnek alınmalıdır. Anogenital kültürlerin duyarlılığı %95’in üzerindedir. Yaygın İnfeksiyon varlığında kan kültürleri yapılabilir.

Örneklerin Nakli

Alınan örneklerin doğrudan çoğalma besiyerine konulması üreme için ideal olandır. Ancak pratik değildir. Örneklerin nakli değişik taşıyıcı sistemler aracılığı ile sağlanabilir;

Stuart’s veya Amies’nin semisolid taşıyıcı besiyeri en pratik olan ve çok kullanılan besiyeridir. Kültür media transport sistemler daha çok örneklerin referans laboratuarlara nakledilmesi sırasında kullanılır.

İnokülasyon ve İnkübasyon

Gonokoklar için modifiye Thayer Martin (MTM) besiyeri, Martin-Lewis (ML) besiyeri, New York City (NYC) besiyeri ve GC-Lect besiyeri kullanılanılabilir.Bu besiyerlerinin tümü, diğer bakteri inhibe etmek amacı ile antibiyotik içerir. Vankomisin ve kolistin daima bulunan antibiyotiklerdir. Trimetoprim, proteusları, amfoterisin B mayaları inhibe etmek için katılır.

Hangi besiyeri olursa olsun, ekim yapılmadan önce besiyeri oda ısısında olmalıdır. Plaklar %3-7 CO2’li ortamlarda (desikatör veya CO2 inkübatör) 35-37 oC’de nemli ortamda inkübe edilmelidir.

Neisseria meningitidis’in izolasyonu

Meningokokal hastalıklarda örnekler, beyin omurilik sıvısı, kan, nozofaringeal-orofaringeal sürüntü ve biyopsi örnekleridir. Alınan örnekler gonorede olduğu gibi zenginleştirilmiş besiyerlerine ekilir ve aynı şekilde enkübe edilir (1).

PATOJENİK NEİSSERİA’LARIN İDENTİFİKASYONU

Neisseria Gonorrhoeae

Koloni Morfolojisi

Gonokoklar kültürde birkaç tip koloni meydana getiri. Kellogg’un şemasına göre, koloniler T1’den T5’e kadar adlandırılır.Renk, kolonilerin topografisi, ışığı yansıtması ve  daha bir  çok özellik farklı olabilir. Hücresel seviyede pilili koloniler P+ ve P++ (önceden T1 ve T2), pilisiz koloniler P-(T3,T4,T5) olan kolonilerdir. Opak koloniler O+ ve O++, trasparan koloniler O- olarak adlandırılır. Bu değerlendirmeler antibiyorik ilave edilmiş  çikolata agardan ibaret olan MTM agarda yapılır.

Primer kültürde P+ ve P++ koloniler dominanttır. Bu koloniler küçük, parlak ve kabarıktır. Atipik gonokoklar farklı koloniler meydana getirebilir.

Gram Boya ve Oksidaz Testi

N.gonorhoeae için ekim yapılmış plakların ilk değerlendirmesi el büyüteci veya mikroskop yardımı ile, ekimden 24 saat sonra olmak üzere 48 ve 72 saatlik inkübasyonlardan sonra yapılır. Şüpheli kolonilerden gram preparat hazırlanır  ve oksidaz testi yapılır. Gram boyada gram negatif tipik diplokoklar halinde, genç kolonilerde yer yer tetratlar ve diplokoklar halinde görülür.

En iyi oksidaz testi oksidaz reagentinin tetrametil derivesi ile yapıldığında elde edilir. Test için bu solüsyon bir parça filtre kapağına damlatılır ve şüpheli koloniden öze veya eküvyon ile bir parça alınarak reagentin üzerine sürülür. 10 saniye içinde koyu mor bir renk meydana gelir.

Superoksol Testi

Superoksol testi N.gonorrhoeae’nin hızlı tanımlaması için diğer yardımcı bir testtir. Suparoksol %30’luk hidrojen peroksittir. Bir cam üzerine alınan koloninin üzerine superoksol damlatıldığında köpüklenme ve kabarcıklaşma meydana gelir.

Diğer Organizmadan Ayrımı

Neisserialar için seçici besiyerlerinde başka bakterilerde üreyebilir. Kingella, Moraxella, Acinetobacter, Camnocytophaga bu bakteriler arasında sayılabilir. Ancak Kingella’da katalaz testi negatiftir. Moraxella’da oksidaz ve katalaz testleri pozitif olduğundan penisilin disk testi ile ayırıcı tanıya gidilir. Acinetobacter’de oksidaz reaksiyonu negatiftir. Capnocytophaga’da oksidaz testleri negatiftir.

N.gonorrhoeae İçin Tanı Kriterleri

Üregenital sahadan alınan örneklerde seçici besiyerlerinde üreyen, oksidaz ve superoksol testleri pozitif, gram negatif diplokoklar N.gonorrhoeae’dir. Ürogenital bölge  dışında ve çocuklardan izole edilen gonokokların en az iki farklı yöntemle doğrulaması yapılmalıdır. Karbonhidrat utilizasyon testi ve immünolojik yöntemler (monoklonal antikorlar, floresans testi gibi), enzimatik yöntemler veya DNA prob kültür doğrulama testleri bu amaçla kullanılabilir.

Neisseria Meningitidis

Başta beyin omurilik sıvısı olmak üzere klinik örneklerden hazırlanmış gram boyalı preparatlarda polimorfonükleer hücrelerin içinde dışında gram negatif diplokoklar şeklinde görülür. Kapsüllü olan bakterilerin etrafında pembe bir halo görülebilir. İnflamatuar hücrelerin varlığı prognostik değere sahip olduğundan ve bakteri yoğunluğu hakkında fikir verdiğinden gram yayma çok önemlidir. Gram boya kültüre ilaveten meningokokal kapsüller polisakkarirleri için direk antijenik test yapılabilir. Kapsüler antijenler A.B.C.Y ve W135 için direk antijen testleri mevcuttur. Pozitif testler erken tanı için önemli olmakla birlikte negatif sonuçlar tanıdan uzaklaştırmamalıdır. Sonuçlar kültür ve gram boya ile doğrulanmalıdır.

Meningokoklar, kanlı ve çikolata agarda selektif besiyerlerindeki kadar iyi ürerler. BOS örnekleri seçici olmayan besiyerlerine ekilmelidir. Fakat orofarinks veya nozofarinksten alınan örnekler, diğer bakterilerin üremesini engellemek için seçici besiyerlerine ekilmelidir. Petriler %5-7 CO2’li ortamda 35oC’de enkübe edilmeli ve 24,48 ve 72 saat sonra incelenmelidir.

Meningokokların identifikasyonunda en iyi sonuçlar çikolata ve kanlı agarda yapılan 18-24 saatlik taze subkültürlerden inoküle edildiğinde elde edilir. Glikoz negatif, maltoz negatif ve asakkarolitik meningokok suşları izole edilmiştir. Biyokimyasal testlerde karmaşık sonuçlar alındığında kromojenik ve slide-aglutinasyon testleri ile dorulamaya gidilmelidir.

Slide-aglutinasyon testi meningokokların serogruplaması için en yaygın kullanılan testtir. Serogruplamaya ilaveten, meningokok izolatları dış membran proteinlerine ve LOS antijenlerine göre de serotiplendirilebilir ve  subserotiplendirilebilir. Bu tetkikler esas olarak endemik hastalığın epidemik ve sporadik salgılarından kullanılır ve rutin mikrobiyolojik tetkikler değillerdir. Bu serolojik tetkiklere ilaveten moleküler tetkikler de meningokokların tanısında kullanılır. Multilokus enzim elektroferoz, rRNA  prob teknolojisi, PCR ve ‘pulse field gel electrofphoresis N.meningitidisin tanısında kullanılan moleküler tekniklerdir (1).

PCR teknikleri ile az miktardaki bakteri DNA’sını bile tanımlayabilmekte olup meningokokal enfeksiyonlarda hızlı tanı amacı ile kullanılabilmektedir. Meningokokal menenjitte duyarlılık ve özgüllüğü %90’ın üzerindedir. Öncesinde antibiyotik almış olan vakalarda kültürün duyarlılıkları düşmekle birlikte antibiyotik kullanımının multiplex PCR üzerine anlamlı etkisi görülmemiştir ayrıca kültüre göre daha hızlı bir şekilde tiplendirme yapılabilmektedir (25,26).

Multiplex PCR ile ek olarak meningokokal, pnömokokal ve H. influenzae arasında da hızlı bir şekilde ayırım yapılabilmektedir (25).

Real-time PCR ile 24 saat içinde %96 duyarlılık ve %100 özgüllük ile meningokok tanısı konulabilmektedir. Duyarlılık oranlarının %63 olduğu kültür yöntemleri ile karşılaştırılırsa özellikle çocuklarda daha kısa sürede kesin sonuçlar alınabilmektedir (27)

Konvansiyonel kültür yöntemlerinin en önemli avantajı ise duyarlılık sonuçlarını verebilmesidir. Günümüzde nadir olarak penisilin dirençli suşlar bildirilsede dünyanın birçok yerinde penisiline duyarlılığı devam etmektedir. Bu nedenle birçok labarotuvarda rutin olarak duyarlılık sonucu çalışılmamaktadır (28).

Diğer Neisseria’lar

N.lactamica

Koloni morfolojisi N.meningitidis’e benzer ve önceleri meningokokların laktoz-pozitif bir varyantı zannedilmiştir. Seçici besiyerlerinde ürer ve glikoz, maltoz ve laktozdan asit meydana gelir. Laktozdan asit ve beta galaktozidaz üreten tek türdür (29)

N.cinerea

İlk olarak Micrococcus cinereus olarak tanımlanmakla birlikte DNA hibridizasyon yöntemlerinin kullanımı ile birlikte ayrı bir alt tür olarak tanımlanmıştır. Yenidoğan konjonktivitenden, endoservikal – rektal enfeksiyonlardan ve lenfadenitlerden izole edilmiştir. Asit üretimi ile tiplendirme yapılacak olursa yanlışlıkla M. catarrhalis, N. flavescens ve glikoz negatif gonokok olarak tiplendirilebilir (29). Kolonileri gonokokların geniş tip kolonilerine benzer. Kanlı ve çikolata agarda ürer ve komensal floranın bir üyesidir. Çikolata agarda 24 saatlik inkübasyondan sonra 1 mm çapında ve düzgün koloniler meydana getirir. Karbonhitratlardan asit meydana getirmez. N.cinerea ve N.gonorrheae’nin ayrımında kolistin duyarlılık testinden yararlanılır. N.cinerea kolistine duyarlı (bazı suşlar dirençli olabilmektedir), N.gonorheae dirençlidir (Neisseriaea’ların kolistin duyarlılıkları tablo 147.2’de verilmiştir).

Tablo 147.2: Neisseriaea’ların kolistin duyarlılıkları (29 no’u kaynaktan uyarlanarak alınmıştır)

                  TÜR KOLİSTİN                DUYARLILIĞI
N.gonorrhoeae R
N.meningitidis R
N.lactamica R
N.cinerea (R)
N.polysaccharea (R)
N.subflava S
N.sicca S
N.mucosa S
N.flavescens S
N.elongata S
N.kochii R

R, N. gonorrhoeae selektif agarda iyi ürer ve/veya 10 mcg’lik kolitsin diski etrafında inhibisyon görülmez; (R), birçok suş duyarlı olmakla birlikte bilinen dirençli suşlar mevcut; S, bilinen dirençli suş yok.

N.flavescens

Bir epidemik menenjit salgını sırasında izole edilmiş olup hem kommensal hemde patojenik karakteristikler taşımaktadır. Pigmente, kolitsin duyarlı ve sükrozdan polisakkarid üretmektedir. Enzim substrat testleri ile yanlışlıkla gonokok olarak tiplendirilebilmektedir (29). Kanlı ve çikolata agarda düzgün, sarımtırak koloniler meydana getirir. 35oC üreyebildiği gibi oda ısısında da ürer.

N.subflava biovarları, N.sicca ve N.mucosa

Nadiren İnfeksiyon nedenidirler. Koloni morfolojisi, basit veya seçici besiyerlerinde üreme özelliği, karbonhidratlardan asit meydana getirmeleri, nitrat ve nitrit redüksiyonları ile tiplendirilirler. N.mucosa nitratı indirgeyemez. Yanlışlıkla gonokok olarak tiplendirilebilir (29).

N.polysaccharea

Orafarinkste bulunan ve yeni tanımlanmış bir Neisseriadır. Oksidaz ve katalaz pozitif, düzgün yeşıl kolonili gram negatif diplokoklardır. Seçici besiyerlerinde duyarlı oldukları antibiyotiklere göre farklı üreme özelliği gösterirler. Glukoz ve maltozdan asit meydana getirir, ancak fruktoz ve laktozdan getirmez.

N. elongata alt türleri

N. elongata subspecies elongata, glycolytica ve nitroreducens Neisseriaların çomak şeklindeki üyeleridir. Üst solunum yollarının normal flora üyeleridir. Katalaz reaktiviteleri, glukozdan asit oluşturmaları nitrat redüksiyonu ile ayırımlarına gidilir. Orofarengeal florada kommensal olarak bulunsada enfektif endokardit, osteomyelit, sepsis gibi ciddi enfeksiyonlarada yol açabilmektedir (3).

N.gonorhoeae subspecies Kochii (N.kochii)

1986’da Mısırda çocukların konjonktiva kültürlerinde izole edildi. Gonokoklara benzer. Oksidaz pozitiftir ve glukozdan meydana getirir. Gonokoklara benzer şekilde niratı redükte etmez, DNase negatif, pigmentsiz ve sükrozdan polisakkarid meydana getirmezler. Asit üretimi veya enzim substrat testlerinin kullanılması halinde yanlışlıkla gonokok olarak tiplendirilebilirler (29).

NEİSSERİA’LARDA ANTİBİYOTİK DİRENCİ

Gonokoklarda antibiyotik direncine gonore konusunda değinileceğinden bu kısımda anlatılmayacaktır.

N.meningitidis’te antibiyotik direnci

Meningokoklarda, penisilin duyarlılığı devam ettiğinden duyarlılık testi yapılması rutin değildir. Ancak 1983’de Dilton ve grubu  B- laktamaz meydana getiren meningokok suşları izole edilmiştir. 1988’de Güney Afrika’da iki menenjitli hastada ve İspanya’da B-laktamaz meydana getiren meningokok bildirimleri yapılmıştır. Penisiline dirençli veya duyarlılığı azalmış olan suşlar İngiltere, İspanya ve daha az oranda da Amerika Birleşik Devletlerinde bildirilmiş olup bu suşlarda PBP 2 ve 3’e azalmış afinitenin olduğu gösterilmiştir. Bu vakalarda MIC sonuçlarına göre 3. kuşak sefalosporinler verilebilmektedir (Tablo 147.3). Fazla miktarda beta laktamaz üretimine bağlı olarak dirençli suşlarda bildirilmekle birlikte neyseki oldukça nadirdir (28). Penisiline duyarlı meningokokların MIC değeri 0,05 ug/ml veya altında iken relatif olarak dirençli suşlarda MIC 0,10-1 ug/ml arasındadır. PBP2’ye azalmış afinite diğer Neisseria türlerinde de gösrerilmiştir. Antibiyotik tedavisine cevap vermeyen vakalarda  E-test ile duyarlılık araştırmalıdır (1,30)

Tablo 147.3: Meningokoklarda 2.-3. kuşak sefalosporin duyarlılık BOS penetrasyonları, kinetikleri (28)

SEFALOSPORİN DUYARLILIK (μg/mL) BOS KONSANTRASYONU (μg/mL) BOS PENETRASYONU (%)
SEFUROKSİM <0.2-1.6 1.1-17.1 11.6-13.7
SEFTRİAKSON <0.001 2.1-7.2 1.5-7.4
SEFOTAKSİM <0.008 1.2-83 4-54
SEFTAZİDİM 0.007-0.5 2.5-30 14

KAYNAKLAR

  1. Koneman EW, Allen SD,Janda WM, et al. Neisseria species and  Moraxella catarrhalis. Diagnostic Microbiology. Lippincott, New Yerk;5th ed. 1997:491.
  2. Fazlı ŞA.Neiseria ve Branhamella. Ustaçelebi Ş. Temel ve Klinik Mikrobioloji kitabından, Güneş Kitabevi; 1999: 371.
  3. Janda W, Gaydos CA. Neisseria. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA. ed. Manual of Clinical Microniology. 9th. ed. ASM pres,Washington, D.C. 2007: 601.
  4. Hsiao JF, Lee MH, Chia JH, Ho WJ, Chu JJ, Chu PH. Neisseria elongata endocarditis complicated by brain embolism and abscess. Journal of Medical Microbiology(2008), 57,376–381.
  5. Heydecke A, Andersson B, Holmdahl T, Melhus A. Human wound infections caused by Neisseria animaloris and Neisseria zoodegmatis, former CDC Group EF-4a and EF-4b. Infection Ecology and Epidemiology 2013, 3: 20312.
  6. Andersen BM, Steigerwalt AG,O’Connor SP et al. Neisseria weaveri SP. Nov., formerly CDC group M-5, a gram-negative bacterium associated with dog bite wounds. J Clin Microbiol 1983;31:2456.
  7. Andersen BM, Weyant RS, Steigerwalt AG et al.. Characterization of Neisseria elongata subsp. Glycolytica isolates obtained from human wound specimens and blood cultures.  J Clin Microbiol 1995;33:76.
  8. Veron M, Lenvoise-Furet A, Coustere C, et al. Relatedness of three species of ‘false neisseria’  Neisseria caviae. Neisseria cuniculi and Neisseria ovis, by  DNA-DNA hybridizations and fatty acid analysis. Int J syst Bacteriol 1993; 43:210.
  9. Heckels JE. Structure and function of pili of pathogenic Neisseria species. Clin Microbiol Rev 2 (Supp) 1989;66.
  10. Scheuerpflug I, Rudel T, Ryll R, et al. Neisseria gonorhoea and Neisseria meningitidis to human erythrocytes and endothelial and epithelial cells. Infect Immun 1999;67:834.
  11. Perin A, Nassif X, Tnsley C. Identification of regions of the chromosome of  Neisseria meningitidis and Neisseria gonorhoeae which are spesific to the pethogenic neisseria species. Immun 1999;67.6119.
  12. Mosleh IM, Boxberger HR, Sesler MJ, Meyer T. Experimental infection of native human ureteral tissue with Neisseria gonorrhoeae: Adhesion, invasion, intracellular fate, exocytosis, and passage through a stratified epithelium. Infect Immun 1997;65:3391.
  13. Desai PJ, Nzeribe R, Genco C. Binding and accumulation of hemin in Neisseria gonorrhoeae. Infect Immun 1995;63:4634.
  14. Gold R, Goldschneider I, Lepow ML, et al. Carriage of Neisseria meningitidis and Neisseria lactanica in infants and children. J Infect Dic 1978;137:1574.
  15. Lujan R, Zhang Q-Y, Saez-Nieto JA, et al. Peniciline, resistant isolates Neisseria lactamica produce altered forms of penicilinle-binding protein 2 that arose by horizontal gene tranfer. Antimicrob Agents Chemother 1991;35:300.
  16. Anderson MD,Miller LK. Endocarditis due to Neisseria mucosa. Clin Infect Dis 1993;16:184.
  17. Deger R,Ludmir J. Neisseria sicca endocaditis complicating pregnancy- a case report.J Reprod Med 1992;37:473.
  18. Haris LF.Neisseria subflava endocarditis. Arch Intern Med 1981;141:545.
  19. Clausen CR, Knapp JS, Totten PA. Lymphadenitis due to Neisseria cinerea.Lancet 1984;1:908.
  20. Boyce JM, Taylor MR, mitchell EB et al. Nosocomial pneumonia causet by glucose- metabolizing strain of Neisseria cinerea.J Clin Microbiol 1985;21:1
  21. Cann KJ, Rogers TR. The phenotypic relationship of Neisseria polysaccharea to commensal and pathogenic  neisseria sp.J Clin Microbiol 1989;39:351
  22. Sherrard J, Barlow D.Gonorrhoea in men: clinical and diagnostic aspects. Genitourin Med 1996;72:422.
  23. Borlow D, Phillips I.Gonorrhoea in women: diagnostic, clinical and laboratory aspects. Lancet 1978;1:761.
  24. Jephcott AE. Microbiological diagnosis of gonorrhoea.Genitourin Med 1997;73:245.
  25. Corless CE, Guiver M, Borrow R, et al: Simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, and Streptococcus pneumoniae in suspected cases of meningitis and septicemia using real-time PCR. J Clin Microbiol  2001; 39:1553-1558.
  26. Diggle MA, Clarke SC: Detection and genotyping of meningococci using a nested PCR approach. J Med Microbiol  2003; 52:51-57.
  27. Bryant PA, Li HY, Zaia A, et al: Prospective study of a real-time PCR that is highly sensitive, specific, and clinically useful for diagnosis of meningococcal disease in children. J Clin Microbiol  2004; 42:2919.
  28. Apıcella MA. Neisseria meningitidis. In: Mandell GL. Bennett JE, Dolin R.eds. Principles  and Practice of  Infectious Disease. 7th ed. New York: Churchill Livingstone; 2010:2737.
  29. http://www.cdc.gov/std/gonorrhea/lab/Nlac.htm
  30. Ropp PA, Nicholas RA. Cloning and characterization of the pon A gene encoding penicilin-binding protein 1 from Neisserial gonorhaea and neisseria meningitidis.J Bacteior 1997,179:2783.  

Bir Cevap Yazın